Analisi strutturale di un endogeno 4

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 552 (2023) Citare questo articolo

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Il complesso dell'ossoglutarato deidrogenasi (OGDHc) partecipa al ciclo dell'acido tricarbossilico e, in una reazione a più fasi, decarbossila l'α-chetoglutarato, trasferisce il succinile al CoA e riduce il NAD+. A causa del suo ruolo fondamentale nel metabolismo, i componenti enzimatici dell'OGDHc sono stati studiati isolatamente; tuttavia, le loro interazioni all'interno dell'OGDHc endogeno rimangono sfuggenti. Qui, discerniamo l'organizzazione di un OGDHc termofilo, eucariotico, nativo nel suo stato attivo. Combinando metodi biochimici, biofisici e bioinformatici, ne risolviamo la composizione, l'architettura 3D e la funzione molecolare con una risoluzione di 3,35 Å. Riportiamo inoltre la struttura crio-EM ad alta risoluzione del nucleo OGDHc (E2o), che mostra vari adattamenti strutturali. Questi includono modelli di legami idrogeno che confinano le interazioni degli enzimi partecipanti all'OGDHc (E1o-E2o-E3), il tunneling elettrostatico che guida la comunicazione tra subunità e la presenza di una subunità flessibile (E3BPo), che collega E2o ed E3. Questa analisi multiscala di un estratto di cellula nativa che produce succinil-CoA fornisce un modello per studi struttura-funzione di miscele complesse di valore medico e biotecnologico.

Il complesso dell'ossoglutarato deidrogenasi (OGDHc) è uno dei principali regolatori del flusso metabolico nel ciclo tricarbossilico (TCA), il che significa che le cellule mantengono l'abbondanza e l'attività di OGDHc sotto stretto controllo1,2. Negli eucarioti, l'OGDHc è attivo nel mitocondrio, ma una frazione del complesso si localizza anche nel nucleo effettuando la succinilazione della lisina degli istoni3. La reazione catalizzata dall’OGDHc – la decarbossilazione dell’ossoglutarato (α-chetoglutarato) in succinil-CoA – è importante per la produzione di energia, l’interazione metabolica tra mitocondri e citoplasma nonché il metabolismo dei neurotrasmettitori. Questo perché l'ossoglutarato (α-chetoglutarato) viene generato nel ciclo del TCA durante l'ossidazione dei carboidrati e degli acidi grassi e dalla glutammato deidrogenasi durante la deaminazione ossidativa del glutammato. Viene inoltre prodotto dalla transaminazione del glutammato come parte della navetta malato-aspartato, che trasferisce gli equivalenti riducenti dal citoplasma ai mitocondri. Questa posizione cruciale dell'OGDHc nel metabolismo e l'associazione tra la ridotta attività dell'OGDHc nel cervello e la neurodegenerazione hanno stimolato ricerche approfondite4,5. Inoltre, l'OGDHc è altamente sensibile alle specie reattive dell'ossigeno (ROS)6 e la sua possibile inibizione dovuta allo stress ossidativo potrebbe rivelarsi dannosa per il metabolismo complessivo della cellula. Tali condizioni cellulari associate al cancro possono avere un impatto sull'attività dell'OGDHc7, soprattutto considerando che l'ossoglutarato è un effettore della soppressione del tumore mediata da p538. Di conseguenza, comprendere le relazioni struttura-funzione dell'OGDHc è di particolare interesse.

A livello molecolare, OGDHc è un insieme delle dimensioni di un megadalton di copie multiple di tre enzimi, vale a dire E1o (ossoglutarato deidrogenasi, EC 1.2.4.2), E2o (diidrolipoil succiniltransferasi, EC 2.3.1.61) ed E3 (diidrolipoil deidrogenasi, EC 1.8. 1.4). E2o costituisce il nucleo del complesso con una stechiometria stabile di 24 copie in un assemblaggio cubico, mentre le proteine ​​E1o ed E3 si assemblano alla sua periferia per eseguire la reazione completa in un metabolone di ordine superiore ancora stechiometricamente e strutturalmente sconosciuto (Fig. 1A ). Sebbene i singoli componenti enzimatici dell'OGDHc siano stati risolti strutturalmente e sia stata studiata la caratterizzazione cinetica dei suoi passaggi discreti9,10,11 (Fig. 1B), la loro intercomunicazione è sconosciuta, ostacolando, quindi, gli studi struttura-funzione alla base di questo metabolone. A causa della difficoltà di sondarne la struttura e la funzione endogene, la moderna analisi della spettrometria di massa combinata con la modellazione basata sul cross-linking è stata recentemente impiegata per ricavare informazioni sulla prossimità delle subunità di OGDHc a bassa risoluzione senza sondarne l'attività12. Ciò è dovuto al fatto che il metabolone non è stato ancora ricostituito in vitro come entità funzionale nonostante decenni di ricerca. Inoltre, il dominio lipoilico (LD) che trasferisce gli intermedi lipoilici da un sito attivo a quello successivo (E1o → E2o → E3) fa parte di un braccio E2o altamente flessibile, rappresentando una sfida particolare per il suo studio con metodi strutturali tradizionali. Il potenziale coinvolgimento di ulteriori elementi strutturali, come subunità che potrebbero contribuire alla comunicazione incrociata di OGDHc, cioè KGD413, complica ulteriormente la caratterizzazione del complesso.