Profilazione delle proteine ​​superficiali della prostata

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 1402 (2022) Citare questo articolo

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Le vescicole extracellulari (EV) sono mediatori della comunicazione intercellulare e una promettente classe di biomarcatori. Le proteine ​​superficiali degli EV svolgono un ruolo decisivo nello stabilire una connessione con le cellule riceventi e sono bersagli putativi per i test diagnostici. L’analisi delle proteine ​​di superficie può quindi sia illuminare le funzioni biologiche dei veicoli elettrici sia aiutare a identificare potenziali biomarcatori. Abbiamo sviluppato una strategia che combina la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) e i test di legatura di prossimità (PLA) per identificare prima e poi convalidare le proteine ​​di superficie scoperte sui veicoli elettrici. Abbiamo applicato il nostro flusso di lavoro per studiare le proteine ​​superficiali di piccoli EV presenti nel liquido seminale (SF-sEV). Abbiamo identificato 1.014 proteine ​​di superficie e verificato la presenza di un sottoinsieme di queste sulla superficie degli SF-sEV. Il nostro lavoro dimostra una strategia generale per l'analisi approfondita delle proteine ​​superficiali degli EV nei pazienti e nelle condizioni patologiche, procedendo dallo screening imparziale mediante HRMS ad analisi mirate ultrasensibili tramite PLA.

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle a doppio strato lipidico secrete dalla maggior parte delle cellule. Esistono tre sottogruppi principali di EV, classificati in base alle loro dimensioni, biogenesi e densità: (i) esosomi, (ii) microvescicole e (iii) corpi apoptotici. Gli esosomi sono piccoli EV (sEV) con una dimensione compresa tra 30 e 150 nm, generati dalla gemmazione verso l'interno degli endosomi, che portano alla produzione di corpi multivescicolari (MVB). Gli MVB alla fine si fondono con la membrana plasmatica e rilasciano il loro contenuto sEV nella matrice extracellulare e nei fluidi corporei, dove è stato dimostrato che gli sEV svolgono un ruolo critico nella comunicazione intercellulare1,2,3,4,5. Microvescicole con un intervallo di dimensioni compreso tra 100 e 800 nm e corpi apoptotici con un intervallo di dimensioni compreso tra 200 nm e 5 μm vengono rilasciati direttamente dalle membrane plasmatiche delle cellule vitali e di quelle sottoposte a morte cellulare programmata, rispettivamente. Gli sEV, così come le microvescicole e i corpi apoptotici, possono mediare il trasporto intercellulare per il trasporto di carichi molecolari contenenti proteine, lipidi, piccoli RNA e altre specie di RNA e frammenti di DNA genomico1,7,8.

Studi recenti hanno dimostrato che il contenuto dei veicoli elettrici differisce a seconda della loro linea cellulare e che quindi riflettono le cellule da cui provengono. L'analisi della variazione dinamica delle impronte digitali sEV può fornire un mezzo prezioso per tracciare e monitorare le malattie9,10,11,12,13. Gli attuali studi molecolari e i test incentrati sui biomarcatori circolanti valutano principalmente il contenuto di RNA e di lipidi degli sEV circolanti, ma c'è un crescente interesse anche per indagare la composizione proteica degli sEV3. In particolare, le proteine ​​di superficie degli EV sono di grande interesse per il loro ruolo nello stabilire un contatto con le cellule bersaglio, che può portare al loro assorbimento cellulare o alla fusione con la membrana plasmatica prima del rilascio dei loro carichi molecolari14.

Gli sEV del liquido seminale (SF-sEV), noti anche come prostasomi, vengono secreti dalla ghiandola prostatica nel liquido seminale, dove una delle loro funzioni chiave è quella di interagire direttamente e proteggere le cellule spermatiche15,16,17. La fusione degli SF-sEV con la membrana plasmatica dello sperma è necessaria per la regolazione di diversi aspetti della funzione degli spermatozoi, come la motilità e la capacitazione, uno degli ultimi passaggi nella maturazione degli spermatozoi necessari per acquisire la capacità fecondante18,19. Gli SF-sEV sono stati anche implicati nell'interazione tra le cellule tumorali prostatiche e il loro microambiente20. Sono riconosciuti come potenziali biomarcatori nell'infertilità maschile21 e nel cancro alla prostata22,23, ma si sa poco sui meccanismi cellulari che guidano la loro produzione e sui percorsi molecolari che guidano le funzioni SF-sEV.

L'analisi proteica basata sulla spettrometria di massa (MS) è uno strumento efficiente e ampiamente utilizzato per caratterizzare le proteine ​​EV24,25. I dati generati dalla SM hanno contribuito allo sviluppo di database online, come ExoCarta (www.exocarta.org)26 e Vesiclepedia (www.microvesicles.org), che elencano le proteine ​​presenti negli EV, compresi gli sEV27. Diverse tecniche biochimiche sono state applicate per l'analisi basata sulla MS delle proteine ​​di membrana con bassa abbondanza negli EV28. In particolare, reagenti non permeabili alla membrana per la derivatizzazione chimica, come la solfo-NHS-SS-biotina, sono stati implementati per studiare sia le proteine ​​di superficie cellulare29 che le proteine ​​di superficie EV delle cellule tumorali pancreatiche30 e della linea di mastociti HMC-131.