Lo screening genetico avanzato utilizzando la scala spot del fondo identifica un ruolo essenziale per Lipe nell'omeostasi retinica murina

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 533 (2023) Citare questo articolo

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Le microglia svolgono un ruolo nella patogenesi di molte malattie della retina. Le macchie del fondo nei topi spesso sono correlate all'accumulo di microglia sottoretinica attivata. Qui utilizziamo una scala semiquantitativa di punteggio del fondo oculare in combinazione con una pipeline genetica imparziale e all'avanguardia per identificare le associazioni causali tra mutazioni indotte chimicamente e fenotipi del fondo oculare. Tra le numerose associazioni, ci concentriamo su una mutazione missenso in Lipe legata ad un aumento delle macchie gialle sul fondo del fondo nei topi C57BL/6J. Si è scoperto che topi Lipe−/− generati utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9 sviluppano un accumulo di microglia sottoretinica, una degenerazione retinica con ridotta funzione visiva e un profilo lipidico retinico anormale. Stabiliamo un ruolo indispensabile di Lipe nell’omeostasi lipidica della retina/RPE e nella salute della retina. Ulteriori studi che utilizzano questo nuovo modello mireranno a determinare in che modo la disregolazione dei lipidi determina l'attivazione delle microglia sottoretiniche e se queste microglia svolgono anche un ruolo nella successiva degenerazione retinica.

Numerosi studi hanno dimostrato un'associazione tra microglia retinica attivata e malattie come la degenerazione maculare legata all'età (AMD), le distrofie retiniche e la retinopatia diabetica1,2,3,4,5,6,7,8,9. Si discute ancora se queste cellule siano deleterie (promuovendo l'infiammazione)9,10,11,12,13,14,15 o omeostatiche (rimuovendo i detriti)16. In effetti, è possibile che in circostanze diverse possano essere 7,10,17,18,19,20. Proponiamo che l'identificazione dei geni che modulano l'accumulo della microglia sottoretinica ci aiuterà a identificare i percorsi essenziali per l'omeostasi retinica. Inoltre, un’attenta caratterizzazione dei modelli murini risultanti potrebbe anche far luce sui meccanismi che regolano la sorveglianza immunitaria, il traffico cellulare e la neuroinfiammazione nella retina. Con questi obiettivi in ​​mente, qui applichiamo uno screening su scala spot del fondo oculare alla nostra pipeline di genetica avanzata all'avanguardia21,22, il cui più grande vantaggio rispetto ad altri protocolli di genetica avanzata23,24,25,26,27,28,29 , è il fatto che tutti i topi selezionati sono topi G3 che sono stati pre-genotipizzati in tutti i loci mutanti, consentendo una rapida determinazione delle mutazioni causative22. Questo ci offre l’opportunità di perseguire associazioni gene-fenotipo che altri potrebbero ignorare. Negli screening genetici avanzati tradizionali, è necessario un enorme sforzo nel perseguire eventuali "risultati" potenziali perché molti di essi utilizzano l'outcross/intercross per un ceppo di mappatura in combinazione con il sequenziamento dell'esoma per identificare retrospettivamente le mutazioni causative, un processo che è tempo- consumando. Ciò scoraggia la ricerca di associazioni che non portino a patologie gravi.

Sebbene l'esatta composizione delle macchie sottoretiniche bianche/gialle osservate nelle foto del fondo della retina di topo in vari modelli non sia del tutto certa, noi e altri abbiamo precedentemente dimostrato che sono ben correlate con la microglia sottoretinica Iba1+10,30,31,32. Abbiamo sviluppato una scala33 per eseguire un'analisi semiquantitativa rapida e riproducibile di questi punti. Qui, abbiamo utilizzato questa scala dei punti del fondo per esaminare quasi 6000 topi G3 per mutazioni che alteravano i punteggi dei punti del fondo rispetto ai topi selvatici. Abbiamo identificato diversi geni che, quando mutati, portavano all'accumulo di macchie nel fondo. È già noto che sei di questi geni causano patologie retiniche (Tabella Supplementare S1), fornendo la prova di principio. Dalle associazioni gene-fenotipo, abbiamo deciso di perseguire il gene Lipe, sia perché la sua mutazione ha portato ad un forte fenotipo di accumulo di macchie sul fondo oculare, sia perché la scala delle macchie sul fondo oculare era l'unico parametro di screening che ci ha permesso di identificarlo.

In questo lavoro dimostriamo anche che una linea di topo Lipe−/− generata da CRISPR riproduce i nostri risultati di un vasto accumulo di macchie del fondo nelle foto della retina. Mostriamo che sviluppano un accumulo di microglia subretinica e una degenerazione retinica. Caratterizziamo quindi questi topi con enfasi sull'imaging retinico, sull'anatomia e sull'ultrastruttura della retina, sull'ibridazione in situ, sull'elettrofisiologia e sull'immunoistochimica. Infine, utilizzando la cromatografia liquida ad altissima prestazione con spettrometria di massa, dimostriamo che i topi Lipe−/− mostrano un'anomalia nel metabolismo dei lipidi nella retina e nell'RPE.