La microfluidica di affinità consente livelli elevati

Biologia delle comunicazioni volume 5, numero articolo: 1147 (2022) Citare questo articolo

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La degradazione delle proteine ​​mediata dalla via ubiquitina-proteasoma regola gli eventi di segnalazione in molte condizioni fisiologiche e patologiche. I test di degradazione in vitro sono stati determinanti nella comprensione di come sono regolati la proliferazione cellulare e altri processi cellulari fondamentali. Questi test sono diretti, specifici nel tempo e altamente informativi ma anche laboriosi, in genere si basano sull'elettroforesi su gel di poliacrilammide a bassa produttività seguita da autoradiografia o immunoblotting. Presentiamo la degradazione delle proteine ​​su chip (pDOC), una tecnologia microfluidica integrata basata su MITOMI per la scoperta e l'analisi della degradazione delle proteine ​​negli estratti privi di cellule. La piattaforma ospita centinaia di microcamere su cui la degradazione delle proteine ​​viene analizzata rapidamente, simultaneamente e utilizzando quantità minime di reagenti in uno o più ambienti fisico-chimici. In sostanza, pDOC fornisce un'alternativa multiplex sensibile al test di degradazione convenzionale, con rilevanza per la ricerca biomedica e traslazionale associata alla proteolisi regolata.

La degradazione delle proteine ​​da parte del sistema ubiquitina-proteasoma è un modulo regolatore centrale attraverso il quale il livello delle proteine ​​in tutte le cellule eucariotiche rimane equilibrato. La deviazione dalla quantità desiderata di ciascuna proteina in un dato momento può essere dannosa per la cellula, portando a disfunzioni dei tessuti e a un'ampia gamma di malattie nell'uomo, tra cui cancro, fibrosi cistica e disturbi neurodegenerativi1,2.

La cascata centrale alla base dell'ubiquitinazione coinvolge tre enzimi: l'enzima E1 lega covalentemente e attiva la molecola di ubiquitina per il trasferimento a un enzima coniugante E2. Quindi, l'E2 coniugato con l'ubiquitina interagisce con un enzima ubiquitina-ligasi E3, che catalizza il trasferimento delle molecole di ubiquitina dall'E2 alla proteina bersaglio, tipicamente tramite un legame isopeptidico a un residuo di lisina. Eventi ripetitivi di ubiquitinazione possono formare una o più catene di porzioni di ubiquitina sulla proteina bersaglio (cioè poliubiquitinazione). Una catena di poliubiquitina riconosciuta dal proteasoma innesca la degradazione delle proteine1,2. Centinaia di diversi enzimi E3 governano l'enorme portata funzionale e la specificità dell'intero processo di ubiquitinazione. Per quanto riguarda la proliferazione cellulare e la regolazione del ciclo cellulare, il complesso/ciclosoma promotore dell'anafase dell'ubiquitina ligasi (APC/C) e il complesso proteico Skp1-Cullin-F-box (SCF) sono particolarmente importanti3,4,5. La specificità del substrato di entrambi i complessi dipende dai co-attivatori: Cdc20 e Cdh1 per APC/C e una delle numerose proteine ​​F-box per SCF, ad esempio Skp2 e β-TrCP6,7,8. Nel complesso, la proteolisi ordinata mediata dagli enzimi E3 regolati dal ciclo cellulare garantisce il ciclo cellulare unidirezionale in tutti gli eucarioti6,7,8,9,10.

Mentre alcune forme di catene di ubiquitina contrassegnano le proteine ​​per la degradazione da parte del proteasoma, la monoubiquitinazione e altre forme di poliubiquitinazione regolano le cascate di segnalazione attraverso percorsi indipendenti dal proteasoma11. Inoltre, l’ubiquitinazione può essere invertita da enzimi chiamati deubiquitinasi in modo da prevenire la proteolisi12. D'altro canto, la degradazione proteasomale potrebbe non essere sempre accoppiata all'ubiquitinazione13. Pertanto, la degradazione delle proteine ​​non può essere dedotta dall'ubiquitinazione e deve essere determinata direttamente.

I test di degradazione delle proteine ​​negli estratti privi di cellule, noti anche come "sistemi privi di cellule", sono stati determinanti nella ricerca sulla biologia cellulare, consentendo analisi dirette e quantitative della proteolisi mediata dall'ubiquitina in ambienti fisiologicamente rilevanti. In effetti, gran parte dei principi del ciclo cellulare sono stati scoperti monitorando la degradazione delle proteine ​​del ciclo cellulare negli estratti di uova di rana o nel ciclo delle cellule umane (vedi ad esempio14,15,16,17,18,19,20). L'uso estensivo di questi "test di degradazione" nell'era moderna di oggi è una testimonianza della loro efficacia (vedi ad esempio21,22,23). È interessante notare che i test di degradazione convenzionali non hanno mai veramente beneficiato delle moderne tecnologie e si basano ancora sull’elettroforesi su gel, sull’autoradiografia o sull’immunoblotting e su grandi quantità di materiale biologico.